蛋白質(zhì)印跡法的步驟是什么呢？
蛋白質(zhì)印跡法是一種蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，最早是由美國人喬治.斯塔克發(fā)明的。它利用電泳技術(shù)把特定組織或細胞中的蛋白質(zhì)分離出來，固定的NC膜或者PVDF膜上，再用特異性抗體檢測特定的抗原。正是能找到引起疾病的抗原，這種技術(shù)現(xiàn)在已被廣泛用于疾病診斷等多個生物領(lǐng)域。下面我們來看看它的豬蹄步驟。
一、原理
與Southern Blot或Northern Blot雜交方法類似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測。
二、分類
Western Blot顯色的方法主要有以下幾種：
i. 放射自顯影
ii. 底物化學發(fā)光ECL
iii. 底物熒光ECF
iv. 底物DAB呈色
現(xiàn)常用的有底物化學發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，發(fā)表文章通常是用底物化學發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表。
三、樣品制備
1.單層貼壁細胞總蛋白的提?。?/p>
2. 組織中總蛋白的提?。?/p>
3. 加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取。
蛋白質(zhì)印跡法，一種找出基因表達錯誤引起的疾病的方法。這種快速能找的導致疾病的抗原，并且特異性抗體（一種蛋白質(zhì)）被著色的優(yōu)勢，在研究遺傳疾病，基因問題，疾病的檢測上運用很多。在其制作的基礎(chǔ)上，也在不斷發(fā)展出新的檢測技術(shù)，如Southern Blot雜交方法。
